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肿瘤干细胞及其肿瘤治疗新策略
作者:张凤春  上海交通大学医学院附属仁济医院 2008-8-22 17:05:57 点击:

    人类在同癌作斗争的这几百年来,肿瘤外科学、肿瘤放射治疗学、肿瘤化学治疗学构成了当代肿瘤治疗的三大传统方法,以及后来产生的免疫治疗、基因治疗等新型治疗方法,在对肿瘤治疗中都有一个共同的思路: 设计治疗方法都是针对高度增殖的癌细胞,最大限度地清除或杀灭肿瘤组织和肿瘤细胞,减少肿瘤的体积和数量。然而这些治疗肿瘤的方法都有其局限性与不彻底性,无法解决肿瘤的复发、转移及化学耐药问题。最新研究表明,就增殖和分化而言,肿瘤细胞是不均一的,引起肿瘤复发转移生长的细胞只占所有肿瘤细胞中的一小部分,被称为肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC)。肿瘤干细胞具有自我更新与分化的能力,分化的细胞占整个肿块的绝大部分体积。因此,要彻底根治肿瘤,针对肿瘤干细胞杀伤可能才是治疗的关键,这是对传统治疗的巨大挑战。发现乳腺癌干细胞存在的美国Michigan大学医学教授Clarke说:“目前传统治疗只是使癌细胞缩小,而不是根除它源头。我们需要做的是如何根除源头,使癌细胞无法再生长。”

一、 肿瘤干细胞

    肿瘤干细胞的真正研究是自1997年Dick等[2]发现人类白血病干细胞开始的。Al-Hajj 等[3]首次成功从人类乳腺癌中分离出肿瘤干细胞,这一成果极大推动了实体瘤干细胞的研究。研究结果显示, Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞虽然只占NOD/SCID小鼠移植乳腺癌细胞的2%,但200个此类细胞即可于接种后五个月,在小鼠乳腺中形成约1cm大小的肿瘤,而数以千计的其他表型细胞则无致瘤能力。具有致瘤能力的细胞亚群能连续传代,并且在新形成的肿瘤中,既含有Lin-ESA+CD44+CD24-/low表型的致瘤细胞,也包含有其他表型的非致瘤性细胞。继乳腺癌等重要发现之后,Singh等[4]发现了CD133+脑肿瘤干细胞。另外,肺癌干细胞、皮肤癌干细胞、肝癌干细胞、胰腺癌干细胞、结直肠癌干细胞也都有报道。 

    肿瘤干细胞特征主要表现在自我更新 分化和增值及浸润。其特征可能是受多种信号通路和微环境共同调控而维持的(图1)。

     图1[13]  肿瘤干细胞致瘤的"瀑布"激活

    肿瘤干细胞可能的致瘤"瀑布"机制:包括其刺激肿瘤持续的生长,存活,导致肿瘤转移和药物抵抗。

    细胞内的物质通过激活的EGF-EGFR, PDGF/ PDGFR, SCF/KIT, hedgehog, Notch 和Wnt/-catenin信号通路被诱导。
展示了这些级联反应可能的交叉途径及这些信号通路的抑制剂。

    瘤干细胞处于相对静止的状态,因此针对分裂细胞进行的治疗很难对其产生影响。而且,肿瘤干细胞过高表达“药泵”Bcrp1/ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2),可将化学治疗药物泵出细胞外,从而逃避化学治疗药物的杀伤[5]。化疗药杀死了占大多数的分化细胞,而留下了少数的肿瘤干细胞。成为日后复发的根源。Harguchi等报道,从肝癌细胞系HuH7分选的SP细胞,表达较高水平的ABCG2和ABCB1多药流出泵,也高表达癌胚抗原相关细胞粘附分子CEACAM6(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule)。通过使用ATP生物发光检定的方法,SP较non-SP部分,显示对化疗药顺铂、5-Fu及健择治疗更高的抵抗。2008年ASCO会议上,JC,Chang等研究35例乳腺癌病人配对活检标本,发现给予4周期的CTX新辅助方案化疗后,标本中CD44+/CD24-细胞的比例由4.8%增加到14.8%(P<0.005),形成微球体的效率显著增加了(P=0.03), 而且CD44+/24- 细胞和微球体分析具有正相关(R=0.8, P<0.05)。第一次从临床的角度强有力地证明了存在化疗抵抗性的肿瘤干细胞。 进一步研究发现,转录后调控可能在修饰参与肿瘤干细胞自我更新的基因功能方面发挥重要作用。针对这些新发现通路的临床实验或许可以根除残余的疾病,并提高许多乳腺癌病人的治愈率。

    一直以来人们推测肿瘤干细胞对放疗具有抵抗性。Phillips等发现MCF-7在干细胞条件下培养形成的乳腺微球体(MCF-7S)与单层培养MCF-7相比,肿瘤干细胞对放疗更具有抵抗性。经过单次剂量10Gy放射治疗后,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)在微球体和单层培养MCF-7中的水平均上升了,但微球体较单层培养MCF-7中的水平低。组蛋白H2AX在照射的单层培养细胞中增加了,但在微球体中没有观察到改变。这些提示与单层培养MCF-7相比,微球体细胞更不容易发生DNA损伤。由此得出结论:乳腺癌干细胞是乳腺癌细胞中相对放疗抵抗的亚群,在短程的分隔照射之后,乳腺癌干细胞数目增加了。这些结果为放疗间歇期间观察到的肿瘤细胞数目增加提供了一个可能的机制。Woodward等假设认为,祖细胞对乳腺癌的放射治疗具有抵抗性,这种抵抗性至少部分是通过Wnt信号通路介导的。为了验证这个假设,他们给原代BALB/c鼠乳腺上皮细胞临床相关的放疗剂量,以此来研究放疗抵抗性。结果发现,祖细胞聚集(Stem cell antigen1+,SP祖细胞)。放疗选择性地增加了具有激活Wnt/β-catenin信号通路转基因鼠中乳腺上皮细胞中祖细胞的富集,而对照组则没有。与SCA阴性细胞相比,照射过的SCA阳性细胞具有选择性的β-catenin和存活素表达增加。在克隆形成实验中,SCA阳性祖细胞的克隆形成没有受到临床放疗相关剂量的影响。放疗同样诱导了人乳腺癌细胞系MCF-7中SP祖细胞的富集。这些资料表明,与分化细胞相比,祖细胞具有不同的生存特性,这样有助于研制针对祖细胞的靶向治疗。

二、 肿瘤干细胞治疗的新策略

    肿瘤干细胞的特征和自身的信号传导通路及微环境的复杂调控系统,或许可以帮助我们解释为什么对传统治疗方法的抵抗和失败:虽然这些方法摧毁了肿瘤绝大部分体积,但不能防止残存的肿瘤干细胞会重新发生作用[11]。所以,有效的治疗方法将需要针对肿瘤干细胞。由此想到:什么信号通路调节着肿瘤干细胞的存活和功能,有无有效的方法来破坏它们?针对肿瘤干细胞治疗策略的切入点可能主要是针对肿瘤干细胞本身和其微环境。(图2)


     图2  治疗策略[12]

    (一) 针对肿瘤干细胞自身的靶向治疗

    1. 抑制和阻断肿瘤干细胞自身信号传导系统

    Notch通路:Notch信号在正常乳腺发育中调节导管分支形成,紊乱的Notch信号维持上皮细胞处于一增殖状态,导致了广泛的导管发育不良,形成癌变。在对97名乳腺癌患者的调查中,高表达Notch1者预后差,高表达Notch2者,生存率高[14]。携带有激活的Notch4基因的转基因老鼠有助于乳腺癌的形成[15]。Fan等[16]使用Notch信号通路阻滞剂γ分泌酶抑制剂(GSI-18)显著降低了成神经管细胞瘤细胞群内CD133+细胞比例(近5倍),消除了SP细胞。由于用Notch抑制剂处理的成神经管细胞瘤细胞没有在老鼠体内有效的形成肿瘤,表明肿瘤干细胞杀伤了。由此可见,针对肿瘤干细胞特异的信号通路抑制剂,可以消除肿瘤干细胞的产生。

    现行的治疗方法包括靶向候选的肿瘤干细胞和他们的微环境。微环境有助于肿瘤干细胞的自我更新。一些可行的
新方法包括靶向这些细胞的ROS状态,削弱其细胞内环境,使凋亡信号易于进入细胞内,抑制肿瘤干细胞的增值。
Wnt/ß-catenin通路:当细胞受到Wnt信号刺激时, Wnt蛋白与 Frizzled (FZD)受体相结合, 活化后的FZD受体, 避免ß-catenin经泛素-蛋白酶体途径降解, 从而使 ß-catenin稳定存在于胞质中, 并很快进入细胞核, 与转录因子TCF/LEF结合成复合体,促进TCF/LEF与特定靶基因的启动子结合, 激活靶基因的转录[17]。Wnt通路的活化可能通过干扰乳腺干细胞正常的自我更新,优先诱导乳腺干细胞异常增殖、转化,最终导致乳腺肿瘤的形成。

    生活素:是凋亡抑制基因家族的一员[24],在细胞分化中调控着丝粒的触及,纺锤丝的形成,修饰p53的检查点,调节血管发生。在细胞应激时,可与热休克蛋白90结合,保护细胞存活及增值。在正常组织中不可测,但在肿瘤细胞中大量表达[25,26]。与STAT3,Wnt信号通路交互,形成网络,生活素拮抗剂对肿瘤干细胞有效[27,28]。而且针对单个信号通路的治疗,容易引起药物接触点的突变而引出耐药[29]。针对生活素所形成的治疗,则可避免这种情况。

    NF-κB信号通路:哺乳动物的核因子kappaB(NF-kB)通常由2个亚单位组成同型二聚体和杂型二聚体,以P50/P65的组成为多见[30]。有功能的NF-kB存在于许多细胞和重要基因Wnt通路的活化可能通过干扰乳腺干细胞正常的自我更新,优先诱导乳腺干细胞异常增殖、转化,最终导致乳腺肿瘤的形成。在细胞中,NF-kB是与其抑制蛋白IkB结合成非活性形式存在于细胞浆中。当被炎症、反应性氧化中间体等激活,使IkB磷酸化、泛素化而致降解,NF-kB从复合物中游离出来,并随即转入核内与靶基因的增强子或启动子的kB元件结合,调控诱导的基因的转录[31,32]。NF-κB其通路特异的抑制剂:PTL, PDTC 以及PDTC的类似物DETC,对乳腺癌细胞MCF-7微球体和SP细胞起抑制作用,对于分化的乳腺肿瘤细胞作用不明显[33]。

    Hedgehog/Bmi-1通路:体外实验证明激活Hedgehog,可以提高Bim-1在乳腺微球体的表达,促进乳腺干细胞自我更新及增殖[18],但体内试验显示再造乳腺的频率减少,提示Hedgehog信号的活化可能促进了乳腺干细胞向祖细胞分化,而不增加再生干细胞的比例[19]。环王巴明与维生素D3竞争SMO蛋白的结合,并抑制SMO蛋白的活性,减少了Shh激活HH通路的效果,下调了乳腺癌干细胞的自我更新及增殖[20],杀伤了前列腺癌干细胞[21],抑制了CD133+的脑胶质瘤的自我更新。长期低浓度的与现有的治疗脑胶质瘤的药物共同作用于脑胶质瘤微球体能起到协同的抗细胞增值和促凋亡作用[22]。

    然而,在同一组织中,肿瘤干细胞和正常干细胞有着显著的相似表型和调解机制[34]。Hedgehog,Wnt和Notch信号通路常促进肿瘤干细胞增殖,同时也促进正常干细胞的自我更新。相反地,肿瘤抑制剂,如P53、P16INK4a及P19ARF在抑制肿瘤干细胞增殖的同时,也抑制了正常干细胞的自我更新[35]。这样就提出了一个问题:在同一组织中,只消除肿瘤干细胞而对正常干细胞没有影响的治疗方法是否可能?也是针对肿瘤干细胞的治疗的极大的困难。

    2. 溶瘤腺病毒靶向杀伤肿瘤干细胞

    Δ24利用了E1A区和E3区突变,与乳腺癌中突变的Rb/P16结合,使病毒特异性的在Rb灭活的细胞中复制[40,41]。PK7(7个赖氨酸残基)是硫酸类肝素蛋白多糖(HSPGS)结合的多聚赖氨酸部分。HSPGS是组成细胞外基质常见的物质,有生成血管和促进生长的特性,在进展性乳腺癌中高表达[42,43]。Ad5-Pk7-Δ24以硫酸类肝素蛋白多糖为靶点,进入乳腺癌细胞中起溶瘤作用[44,45],而Ad5/3-Δ24利用了血清3型受体在许多肿瘤上高表达,从而靶向乳腺选择性复制腺病毒是一种能选择性地在肿瘤内复制感染肿瘤细胞,导致肿瘤细胞溶解,释放出子代病毒,散布至远处的肿瘤,从而杀死增殖的和静止的细胞。Jiang[37]等在体内外实验中利用Δ24-RGD靶向异常的p16INK4/Rb通路,诱导了脑CSCs的自我吞噬,导致其死亡。由于乳腺癌细胞低表达柯萨奇腺病毒受体,Minna等构建了嵌合体腺病毒Ad5-Pk7-Δ24,Ad5/3-Δ24,在体内外实验中,证实了能两者能有效地杀死CD44+CD24-/low及SP细胞[38,39]。癌细胞[46]。这种嵌合体病毒的构建,为溶瘤病毒治疗BSCS提出了新方向。

    (二) 针对肿瘤干细胞微环境的靶向治疗 

    1. 肿瘤干细胞微环境的调控作用

    1978年,Schofield提出了“微环境”假说,用来描述支持干细胞生长的生理性微环境[47]。微环境包括间质细胞、细胞外基质及血管、炎症细胞。长期以来,这个假说在很大程度上被忽视了,直到果蝇研究才使得它重新得到重视。学者们认识到:微环境细胞为干细胞提供了了一个庇护所,使得干细胞免受分化刺激,凋亡刺激及其它刺激的影响,因为这些刺激会威胁干细胞的储量。微环境也抵抗过多的干细胞产生,从而避免癌症的发生。干细胞必须周期性地激活和产生祖细胞或短暂扩充细胞(transit amplifying cell, TAC),这些细胞会定向地产生成熟细胞。因此,维持干细胞静止和活动的平衡是功能性微环境的一个特点。然而,最新研究表明,干细胞微环境可能还发挥着另一个、不被重视的重要功能,那就是通过控制干细胞增殖来防止肿瘤的发生。Li等[48]认为,干细胞微环境的反常调控导致了干细胞增殖失控,进而导致了肿瘤的发生,就像打开了“潘多拉盒子”一样。最近,Chepko等[49]报道,乳腺干细胞微环境的反常调控,导致了TEFα的不正常表达,最终导致了乳腺癌的发生。进一步支持了Li等的假说。Sneddon等[50]用全基因表达图谱的方法,比较了皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)间质细胞和正常皮肤间质细胞的基因表达差异,发现GREMLIN1基因在BCC间质细胞中高表达。GREMLIN1可编码一个BMP信号通路的拮抗剂,其可提高BCC细胞的增殖能力,这和BMP抑制干细胞/祖细胞的增殖是相一致的。BMP拮抗剂是肿瘤基质的重要组成部分,为肿瘤细胞的生成和扩增提供了一个有利的微环境。

    如前所诉,正常干细胞微环境的主要功能是维护干细胞处于一个相对静止的状态,而异常的肿瘤干细胞微环境的主要功能是促进肿瘤干细胞的生长。这些异常的肿瘤干细胞微环境能不能成为肿瘤治疗的靶标?Calabrese等[51]用共聚焦免疫荧光的方法,发现原代脑肿瘤干细胞(CD133+)位于脑肿瘤毛细血管周围。进一步的研究表明,在体外3D matrigel 胶培养体系中,人血管内皮细胞(human endothelial cells,PHECs)选择性地与脑肿瘤干细胞相互作用,而不与CD133-肿瘤细胞发生作用。作者使用Transwell体系证明了PHECs能分泌维持脑肿瘤干细胞处于自我更新和未分化状态需要的细胞因子。在原位脑肿瘤移植物中,增加血管内皮细胞或血管的数量可增加肿瘤干细胞的数量和增加肿瘤的生长。相反地, Bevacizumab抗VEGF治疗可减少肿瘤内血管的数量和脑肿瘤干细胞的数量,并阻止了肿瘤生长。因此,作者认为,抗血管药物治疗阻止了肿瘤生长,至少部分是通过破坏微环境血管实现的,而这个微环境血管对维持肿瘤干细胞生长是关键的。另有研究报道[52],化学治疗药物CPT-11联合Bevacizumab治疗神经胶质瘤,临床上取得了至今为止最好的治疗效果。这种组合方案除了CPT-11的细胞毒作用外,针对脑肿瘤干细胞微环境微血管治疗的Bevacizumab也起着非常重要的作用。肿瘤微血管构成了维持肿瘤干细胞自我更新的微环境,并且这些微环境代表着肿瘤治疗的靶点,为肿瘤干细胞的治疗提供了新的思路。

    为了最终治愈肿瘤,研究者们需要清楚地知道肿瘤干细胞和它的微环境是如何相互作用的,以及它们的相互依存关系和相互接触机械的信号如何调节着干细胞的功能的。斯坦福大学的Blau报道,她的实验室使用体外工程技术深入研制,建立体外三维微环境模型。将来建立一个可以改变干细胞微环境生物化学和生物机械组成的体系是非常有价值的。同样,三维空间中细胞-细胞之间的相互接触也是干细胞微环境的一个重要方面。

    2. 肿瘤干细胞微环境与肿瘤转移

    干细胞微环境在肿瘤的发生上起了决定性的作用,Balic等[53]用光显微镜、荧光显微镜和质谱分析的方法,对50份早期乳腺癌病人骨髓标本中播撒肿瘤细胞(disseminated tumor cells,DTC)的存在情况及DTC中CK(cytokeratin)阳性细胞CD44和CD24的表达情况进行了研究。结果发现,在每个病人所有DTC细胞中,都具有公认的干细胞/祖细胞表型(CD44+CD24-)细胞的存在。这提示,肿瘤转移很有可能是由肿瘤干细胞引起的。有趣的是,通过使用VEGFR1的抗体或把野生型鼠中VEGFR+的细胞剔除掉的方法来阻止VEGFR1发挥其功能,结果消除了转移前集落的形成和阻止了肿瘤转移的发生。相反的,在Id3(inhibitor of differentiation3)基因敲除鼠中选择性地重建Id3 VEGFR+细胞可重新形成集落并使肿瘤发生转移。作者同时发现,VEGFR1+细胞表达VLA-4(整合素α4β1),它是肿瘤特异的生长因子,可在宿主成纤维细胞中上调纤维连接蛋白α(VLA-4配体)的表达,为即将到来的转移性肿瘤干细胞(metastatic cancer stem cells,mCSCs)提供一个许可的微环境。研究显示了VEGFR1+的造血祖细胞在调解肿瘤转移中的必要性。 Dontu等[55]认为,肿瘤的转移能力和肿瘤干细胞本身的特性是密切相关的。比如,乳腺癌干细胞过度表达CXCR4细胞因子,而骨髓基质细胞有其配体CXCL12/SDF-1的表达,从而可把乳腺癌干细胞吸引到骨髓来。这或许是乳腺癌病人骨转移发生率要高的潜在原因之一。mCSC进入组织和器官的优先选择性是由来自微环境部位的因素所介导的,其中包括了氧梯度和其它化学诱导剂[57]。

    肿瘤干细胞与微环境相互诱导,产生了一些功能性的壁龛,壁龛的中心是肿瘤干细胞,而周围则是分化的肿瘤细胞、纤维母细胞、内皮祖细胞、基质等构成的微环境。如果能有方法破坏微环境,能影响肿瘤干细胞的自我更新能力等特征[61,62] 就能有利于根除肿瘤干细胞。肿瘤干细胞转移途径与正常干细胞运输途径相似,通过SDF-1-CXCR4,HGF/SF-c-met, LIF-LIFR,VEGF-VEGFR轴,肿瘤干细胞表面标记CXCR4+,Sca-1+,c-met+,c-kit+,LIF-R+ [63]。SDF-1-CXCR4轴趋化CXCR4+的肿瘤细胞(例如;乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌)至高表达SDF-1的器官中,并在转移灶增殖、分化,形成肿瘤转移[64]。这就意味着,这些因子可以作为治疗肿瘤干细胞的靶点。实验证明HIF-1α的转录共激活抑制剂-毛壳菌素,CXCR4的小分子抑制剂T140和AMD3100,SDF-1或者HGF/SF的重组嵌合体,针对CXCR4或者LIF-R的封闭抗体[65, 66]有效抑乳腺癌干细胞的增殖。我们的实验结果提示正常乳腺基质细胞可抑制乳腺癌干细胞的微球体形成,相反乳腺癌基质细胞可促进乳腺癌干细胞的微球体形成。总之,不论针对基质细胞、基质还是血管等微环境治疗肿瘤干细胞可能均具有良好应用前景。

三、 问题及展望

    通过靶向肿瘤干细胞来遏制肿瘤的生长、复发、转移等是一种全新的治疗肿瘤的方法,但目前肿瘤干细胞的研究仅仅处于起始阶段,如何将这一全新的治疗肿瘤的思路有效地应用到临床实践中,也尚有许多问题有待探索、完善和解决。如何针对肿瘤干细胞进行特异的治疗,而不影响正常干细胞功能的发挥,这是一个关键问题。还应当考虑肿瘤干细胞功能的发挥需要一个适宜的微环境。改变微环境,可能会控制肿瘤的生长。正如Paget提出的“种子与土壤”理论所阐述的那样。尽管人们目前对肿瘤干细胞微环境的起源持有不同观点、各种肿瘤微环境组成也不尽相同,但有一点是肯定的,那就是肿瘤干细胞微环境在肿瘤的发生发展及转移中起着重要作用.相信随着肿瘤干细胞及其微环境研究的不断深入,特别是相关信号转导通路的阐明,必将给肿瘤干细胞的靶向治疗带来新的希望,从而阻止肿瘤复发和转移,诱导细胞遗传学的完全缓解,最终治愈肿瘤。

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   编辑: 王霞(网络中心)

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