目前，呼吸系统感染性疾病的病原微生物检出率仍较低，难以满足临床需求。据调查，我国痰培养加涂片阳性率约为50%，血培养阳性率约为10%~15%。上呼吸道感染、慢阻肺急性加重等的病原学确诊率更低。

这些未能临床确诊的病例，以及危重病患者早期应用广谱抗菌药，使得抗菌药使用更加普遍。这导致耐药菌检出率普遍攀升，耐药菌感染治疗疗效较差，死亡率升高。常规微生物实验室确诊比例低的原因是由于传统检测方法局限性和取标本前使用抗菌药等。因此，发展不依赖于传统培养的微生物分子诊断技术将有助于感染性疾病诊治，提高诊断率，改善治疗预后。

微生物病原学诊断的二代测序技术

分子诊断方法包括用引物放大核酸分子，再进行测序。基于16sRNA的检测技术是根据16sRNA在不同菌种之间存在共性保守序列，同时存在可变序列用于菌种之间的鉴别，采用定量荧光聚合酶链式反应（PCR）技术可以很好地扩增样本中的核酸，用于微生物种属的鉴定。受技术所限，尚存在错配导致特异性的变异。

改良技术陆续用于微生物鉴定，在流感病毒检测中发挥了重要作用。目前可实现2 h内出报告。二代测序技术则直接通过基因序列分析（核酸提取后建库），测序后与样本库中的病原微生物进行比对，从而判断微生物的种类。这种技术在咽拭子、肺泡灌洗、血液、胸水、痰液等标本中都得到了应用。

目前，该技术最快24 h内出报告，但成本相对较高。为提高检测灵敏度，可将引物粘附在纳米颗粒上增加反应面积，或接种于微流控微孔中，以及事先在平板上铺设特异性较强的引物等。这些改良方法极大提高了检测高通量、敏感性和特异性。

微生物检测需要注意什么？

微生物检测方法学的灵敏度与特异性，跟诊断感染的敏感性和特异性是两个概念。从收集标本到诊断取材部位的感染状态需要进行严格的质量控制，防止标本污染，有效提取核酸，以及确定诊断感染指标的理想截断值是微生物分子诊断核心。

大多数情况下，局部正常菌群的存在干扰了对结果的判断。因此，去除菌群背景、增加耐药基因检测以及病原体毒力因素检测有助于判断病原微生物是定植还是感染。

病原微生物诊断的未来

未来病原微生物诊断将是传统方法学继续改良，以及分子诊断和新诊断方法的有效补充。根据病变部位感染“金标准”界定分子诊断阈值，完善标本采样程序。开发适合不同标本、疾病的基因测序组合，使感染的诊断更加个体化。检测病原微生物的毒力因子、耐药基因等也是病原微生物诊断的发展趋势。

此外，分子诊断结合高通量检测病原微生物将有助于微生态研究的进一步开展，在菌群研究和致病机制探索，调控菌群治疗炎症和免疫性疾病上会有新的拓展。