聚合酶链反应（PCR）扩增重组质粒的定点突变技术，是一种制备基因定点突变的常用方法。在定点突变过程中，经常出现所扩增的质粒局部形成以定点突变引物为重复单元的短片段串联重复序列(简称VNTRs)。尽管学界对这种表现做出大量讨论，但多数被粗暴地认为是PCR扩增的假象，其背后的成因仍然是一个未解之谜。在国家自然基金资助下，哈尔滨医科大学医学遗传实验室周春水教授研究小组首次对该短片段串联重复序列的产生机制亮出“答案”，相关学术成果被最新一期国际期刊《先进生物学》所发表。

在制备抗衰老基因GPLD1的磷脂酶活性区点突变过程中，周春水研究小组发现，所产生的重组质粒约1/4含有以该磷脂酶突变引物对为重复单元的短片段串联重复序列，所有重复单元排列方向与GPLD1基因一致，拷贝数2-13不等，并且部分重复单元连接区伴有碱基缺失、插入等突变情况。经过详细排查，他们锁定体外化学合成的突变引物对之中含有少量起始于3’端的单链短引物（体外合成引物时的副产品），是短片段串联重复序列形成的起始因素。

已经知道，定点突变引物对重组质粒予以体外PCR扩增时，所合成的新DNA链不能作为后续PCR扩增模板；而起始于3’端的短引物引导合成的新DNA链则能够作为后续PCR扩增模板。经过两轮扩增后，所扩增的新DNA链5’和3’端各含有一拷贝的定点突变引物，转化大肠杆菌后会形成含有两拷贝串联重复序列的重组质粒。这种3’端的短引物联合定点突变引物只能生成两拷贝串联重复序列。而周春水研究小组在研究中却发现，大部分短片段串联重复序列的拷贝数均在两个以上，那么，两个以上拷贝数的短片段串联重复序列又是如何形成的？

众所周知，PCR扩增反应经常产生引物二聚体，这些引物二聚体（含双拷贝引物对）能够继续引导并延伸上述两拷贝串联重复序列的拷贝数量。由于PCR引物二聚体连接区存在或多或少的碱基缺失，其引导生成的所有重复单元连接区均应该含有碱基缺失。但周春水小组发现，一半以上的重复单元连接区为双链平末端连接，并没有任何基因突变，这就排除了PCR引物二聚体在短片段串联重复序列产生中的主要作用。定点突变引物对由于正反链完全互补，能以双链形式置身于PCR反应体系中，这为DNA双链连接形成引物二聚体提供了物质基础。

因为化学合成的引物5’端缺少磷酸基团，故两段双链引物并不能直接被连接；而生物中存在的非同源末端连接活性，能够提供磷酸激酶活性及双链DNA连接酶活性，可生成平端连接引物二聚体，也可生成带有连接区基因突变的引物二聚体，正是这些引物二聚体引导、延伸了前述两拷贝串联重复序列的拷贝数量。

那么，非同源末端连接活性又是从何而来的呢？因PCR所用Taq DNA聚合酶是基因工程产品，在其纯化富集过程中可能污染少量细菌中存在的非同源末端连接活性，该活性正是形成多种引物二聚体的真正原因。进一步测试表明，将Taq聚合酶预先热处理后，灭活非同源末端连接活性，再进行基因定点突变，该短片段串联重复序列的生成基本消失。

基于上述研究结果，周春水教授和他的博士生胡子琪、林国超等人创建了半单元双拷贝引导法，用于重组质粒编码基因上生成短片段串联重复序列。该方法先以一条3’端起始的半重复单元长度单链引物，引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对（即含两拷贝重复单元），引导重组质粒的后续PCR扩增。这样的方法实施简便，无需后续复杂的基因克隆操作，阳性质粒比率高。所生成的串联重复序列不仅重复单元方向一致、拷贝数可变，而且重复单元连接区之间不存在碱基突变，不会改变基因阅读框，非常适合在编码基因上生成短片段串联重复序列。

我国著名医学遗传学家、中国工程院院张学院士指出，上述研究从实验中偶然发现的一种有趣现象出发，提出科学问题并深入探究分子机制，由此建立的半单元双拷贝引导法，为阐明短片段串联重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及多种神经退行性遗传疾病的关系提供了新型研究工具。同时，半单元双拷贝引导法制备短片段串联重复序列新技术已申报国家发明专利，并获受理。