抗生素药物敏感试验是耐药菌表型鉴定的基础，常规的方法有纸片琼脂扩散法(K-B法)、稀释法、E test法、自动化仪器系统。

稀释法、E test法可以生成定量的MIC结果，依据CLSI的折点判断药敏结果；K-B法根据生成的抑菌圈直径定性判断抗生素的“敏感”、“耐药”和“中介”，检测方法简单、结果容易解读。以上三种方法基本上适用于临床上所有细菌（除不可培养细菌外），但是其手动操作繁琐且耗时长，从接收标本到出具报告至少需要48~72 h，且对于低丰度细菌敏感性和特异性不高，不适合MDR细菌的检测。

自动化仪器系统简化了检测程序，可以产生快速（3.5~16 h）的标准化药敏测试结果，但是成本比手动方法高得多,且不能随意选择抗生素。目前FDA批准使用的全自动化细菌鉴定/药敏系统主要是BD phoenix系统和vitek2系统，将临床标本接种于适合的培养基，结合全自动化细菌鉴定/药敏系统可以快速得到细菌的鉴定结果和抗生素药敏结果，普遍应用在各级医院和疾病预防中心，有利于多重耐药菌感染的早期抗感染治疗。

基因突变或获得耐药基因是多重耐药菌产生耐药性的遗传基础，通过针对性检测基因突变或相关耐药基因是鉴定多重耐药菌的重要方法和途径。

多重PCR技术  PCR是Kary Mullis在20世纪80年代末开发的一种在体外特异性扩增目标DNA序列的技术。基于不同的引物设计，PCR已经被广泛应用于微生物领域病原体的鉴定和抗生素耐药基因的检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、速度快的特点。

对于多重耐药菌的检测，当前的发展趋势是多重实时PCR，该技术通过扩增多个目标DNA片段可以同时检测与耐药表型相关的不同抗生素耐药基因，例如革兰氏阴性杆菌中碳青霉烯耐药相关基因。基于多重PCR技术的BioFireFilmArray®分子诊断系统可在1 h内检测细菌中的耐药基因，其中对MRSA中mecA的敏感性和特异性均为98％，而对 VRE中vanA/B 和碳青霉烯酶基因bla KPC的敏感性和特异性均为100％。

除了耐药基因的检测外，多重PCR对多重耐药菌感染的流行病学调查亦至关重要。Ryuichi Nakano等人利用多重PCR技术首次阐明了在日本流行的CRKP的耐药机制，在高毒分菌株中同时获得了IMP型碳青霉烯酶基因和CTX-M型毒力基因。

但是，多重PCR只能检测具有引物的抗生素耐药基因，因此最终无法对整个耐药基因组进行全面分析。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)  MALDI-TOF MS是近年来发展起来的一种基于蛋白质组学的新型软电离质谱技术，该技术与所采用软件和质谱数据库相结合，自20世纪90年代开始成功应用病原微生物的快速鉴定，具有高效经济、操作简单、敏感性和特异性高等优点。在病原微生物鉴定领域，MALDI-TOF MS既可以鉴定纯菌落，还可从临床样本（血液、尿液、脑脊液）中直接检测病原菌。

随着质谱仪器和相关软件的研究，使用MALDI-TOF MS进行菌株耐药性的检测的难点得到突破，主要方法有直接分析法、酶水解法和曲线下面积法。

直接分析法：耐药菌株的蛋白质或脂多糖结构发生改变，其特征性质谱峰的存在差异，因此可以直接区分耐药菌和敏感菌。自2000年Edwards-Jones等首次提出了采用MALDI-TOF MS快速区分MRSA和MSSA后，随后更多的研究验证了MALDI-TOF MS直接检测多药耐药菌的可行性。

酶水解法：耐药菌株产生的特异性酶水解抗生素，改变抗生素的结构，使其失活是抗生素的耐药机制之一。抗生素水解后其产物的分子量发生变化，在MALDI-TOF MS上会产生其独特的质谱图峰。选择合适的抗生素作为底物与耐药菌株悬液孵育，使用质谱检测底物的分子变化量来判断菌株是否耐药。2011年首次报道MALDI-TOF MS在1-2.5小时内检测细菌中的碳青霉烯酶。

曲线下面积法：根据抗生素-菌株共培养前后菌株浓度质谱峰曲线下面积的比值变化可以判断细菌对该药物是否耐药。理论上来说，这种方法适用于所有的抗生素耐药性检测，但是对于培养时间、抗菌药物浓度及自动化软件等问题仍需要考虑。

宏基因组二代测序（mNGS）  二代测序技术，也称为高通量测序或大规模并行测序技术，是相对于第一代DNA测序技术（Sanger测序法）而言的新型测序技术，国立人类基因组研究所（NHGRI）于2004年启动NGS项目，可以同时对数千至数十亿个DNA片段进行独立测序，具有具有通量高、速度快、成本低的特点。

mNGS是对患者样品中微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）进行全面分析。mNGS不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，可以同时检测出临床样本中的几乎所有病原体，甚至有可能是未知病原体。Illumina测序平台是mNGS最常用的测序平台，最快可在8 h内完成从DNA样本建库到数据分析获取全过程。

Gu Wei等人的研究结果显示mNGS检测细菌的灵敏度和特异性分别为79％和91％。Robert Schlaberg等人利用普通病原体进一步验证了mNGS对感染性疾病诊断的准确性。除了一般细菌的鉴定外，mNGS亦可应用于抗生素耐药性和MDRO的鉴定，来自美国约翰霍普金斯大学医学院的Patricia Simner等人利用IlluminaMiSeqmNGS从10例ICU病房直肠拭子中检测出MDR细菌，其中VRE9例（10号标本传统培养基显示菌落少）、美罗培南耐药的铜绿假单胞菌1例、厄他培南耐药的阴沟肠杆菌1例、携带bla KPC-2的ST-15型肺炎克雷伯细菌1例,和标准微生物培养方法结果具有一致性,由于NGS测序读长短(仅30~450 bp)，其测序时间平均为24~48 h，对于临床上的重症感染的指导仍存在滞后性。

纳米孔测序  纳米孔测序技术事先不需要进行PCR扩增，可以实现单分子实时NDA测序，其依据单链DNA通过蛋白质纳米孔的孔时产生电流变化来识别单个核苷酸分子。相比二代测序，纳米孔测序读长长（>150kb），速度更快，6 h内可实现从采样到结果输出，适用于MRD病原体爆发的快速诊断。

对于MRO应用方面，纳米孔测序可快速检测到MRO的抗药性和耐药决定簇的位置。Lachlan Coin等人研究发现在测序开始的2 h内可以鉴定出样品中存在的大多数耐药基因，并在10 h内鉴定出完整的耐药谱。Lachlan Coin等人对XDR/PDR肺炎克雷伯菌的抗药性的研究进一步证实纳米测序可快速应用于指导临床治疗。NiranjanNagarajan等人还利用纳米孔测序技术联合宏基因组学确定医院环境中机会致病菌的抗生素耐药库，为系统性预防MDR细菌的传播和感染提供可行性。

但是纳米孔测序过程会产生更多的测序错误，有文献显示纳米孔测序检测细菌的灵敏度和特异度分别为75％和81％，而重复测序来提高准确性又会大大增加测序成本。

早期快速多药耐药细菌病原学可以尽早实施精准的抗感染治疗方案，减少广谱抗生素的滥用，减少耐药性的传播，改善临床预后，降低医疗保健成本。本文所回顾的病原检测方法从标本的选择到检测的速度各有优缺点，各级医疗中心可以根据当微生物的流行病学选择合适的检测方法。总之，随着病原学检测技术的研究进步，对多药耐药菌的鉴定将更加便携、快速、经济而精确。